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pShuttle-CMV-N-Myc(腺病毒質(zhì)粒)實驗操作説明

更新時間:2025-09-08      點擊次數(shù):74

pShuttle-CMV-N-Myc自行用于在哺乳動物細胞中表達N端Myc tag(Myc標簽)融合蛋白的重組腺病毒包裝用的穿梭質(zhì)粒。本穿梭質(zhì)粒構(gòu)建后,需要和預(yù)轉(zhuǎn)染了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(8107)以及重組腺病毒包裝細胞配合使用才能完成重組腺病毒的包裝。

pShuttle-CMV-N-Myc含有CMV啟動子可以高效啟動目的蛋白在細胞中的表達;在多克隆位點的5'端含有一個可以編碼Myc標簽的序列,因此可以表達出含有Myc標簽的融合蛋白,可以方便地使用抗Myc的抗體來識別目的蛋白,有利于目的蛋白檢測和分離純化。

本質(zhì)粒為卡那霉素抗性。

重組腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一種常見的用于在培養(yǎng)細胞或動物體內(nèi)表達外源基因的重要工具。重組腺病毒具有感染宿主細胞范圍廣、感染不依賴細胞分裂、高滴度及目的基因表達水平高等特性。常用的腺病毒載體是人類血清5型腺病毒。改造后的人類血清5型腺病毒,刪除了在病毒裝配過程中起關(guān)鍵作用的E1基因和非必須的能表達逃避宿主免疫的E3基因,E1和E3基因的刪除使得重組腺病毒不能自我復(fù)制,同時給外源基因的插入提供了空間,最長可插入7.5kb的外源基因。從而提高了重組腺病毒的的安全性和可操作性。再利用攜帶E1基因的AD-293、293A、HEK293等細胞作為包裝細胞就可以完成重組腺病毒的包裝。

pShuttle系列的穿梭質(zhì)粒攜帶外源目的基因,經(jīng)過Pme I線性化,隨后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(8106)共轉(zhuǎn)染到大腸桿菌BJ5183中,或者轉(zhuǎn)染到已經(jīng)已經(jīng)預(yù)轉(zhuǎn)染了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(8107)中同源重組。BJ5183菌株表達recET基因,具有很高的基因同源重組(homologous recombination)活性,使帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1通過末端反向重復(fù)序列同源重組,實現(xiàn)外源基因與腺病毒基因組的整合。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質(zhì)粒用Pac I線性化后轉(zhuǎn)染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細胞中進行包裝。從而制備獲得高滴度、自我復(fù)制缺陷并且?guī)в心康幕虻闹亟M腺病毒。

目的基因引入時不能含有Pme I及Pac I這兩個酶切位點,如果含有該兩個酶切位點的目的基因,需要對該位點進行突變方可進行基因操作。

pShuttle-CMV-N-Myc質(zhì)粒的主要信息如下:

Feature NucleotidePosition
left inverted terminal repeat1–103
encapsidation signal (ES)183–331
CMV promoter341–933
Myc tag955-984
multiple cloning site986–1034
SV40 polyA1051–1262
Ad5 right arm homology1267–3522
Ad5 left arm homology3570–4452
right inverted terminal repeat4453–4556
pBR322 origin4763–5430
kanamycin resistance ORF6239–7030

pShuttle-CMV-N-Myc質(zhì)粒的圖譜如下:

pShuttle-CMV-N-Myc的多克隆位點的的詳細圖譜見說明書

pShuttle-CMV-N-Myc中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-N-Myc)包括:

Acc65 IAfl IIAge IAsc IAsp718
Blp IBsiC IBsiW IBstB IBsu36 I
Cla IEco72 IEcoN IEsp IFse I
Kpn INru IPml IPvu ISfi I

pShuttle-CMV-N-Myc中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-N-Myc)包括:

BsrGIT`GTAC,A193HpaIGTT|AAC1156
SnaBITAC|GTA679PflMICCAN,NNN`NTGG1934
NheIG`CTAG,C940BstXICCAN,NNNN`NTGG2373
NotIGC`GGCC,GC945BbsIGAAGAC 8/123175
BamHIG`GATC,C986BbvIIGAAGAC 7/113176
HindIIIA`AGCT,T992Bst1107IGTA|TAC3529
EcoRVGAT|ATC1000XcaIGTA|TAC3529
SalIG`TCGA,C1004PmeIGTTT|AAAC3550
MluIA`CGCG,T1010EcoRIG`AATT,C3555
BglIIA`GATC,T1016AvrIIC`CTAG,G4097
PaeR7IC`TCGA,G1022BspHIT`CATG,A5493
XhoIC`TCGA,G1022Psp1406IAA`CG,TT5892
XbaIT`CTAG,A1028RsrIICG`GWC,CG6898
SpeIA`CTAG,T1034DraIIICAC,NNN`GTG7245
ScaIAGT|ACT1039XmnIGAANN|NNTTC7499

pShuttle-CMV-N-Myc質(zhì)粒中推薦使用的測序引物序列如下:

forward primer (888-907): 5′GGTCTATATAAGCAGAGCTG3′

Reverse primer (1048-1070): 5′GTGGTATGGCTGATTATGATCAG3′

pShuttle-CMV-N-Myc的全序列信息:pShuttle-CMV-N-Myc.txt。

 

包裝清單:
產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱包裝
D8137-1µgpShuttle-CMV-N-Myc1μg
D8137-100µgpShuttle-CMV-N-Myc100μg
說明書1份
保存條件:

-20℃保存。

注意事項:

本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途,也不得移交給訂貨人所在實驗室外的任何個人或單位。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。


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