293細胞培養(yǎng)技術(shù)及應用

是腺病毒載體的包裝細胞。腺病毒是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒后用于基因治療研究的熱門載體。直接將腺病毒載體導入人體內(nèi)表達目的基因，治療惡性腫瘤，心血管疾病或一些遺傳疾病已取得可喜進展；利用腺病毒載體在包裝細胞 293中表達分泌性蛋白質(zhì)，如蛋白酪氨酸激酶 1C等亦成為生產(chǎn)重組蛋白的一條途徑。因此完善 293細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)具有越來越重要的市場意義。哺乳細胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式有三種：貼壁培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，無血清懸浮培養(yǎng)。這三種方式均可用于 293細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。

293細胞特性

293細胞是用5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化，含有Ad5 E1區(qū)的人胚腎細胞。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建而成。293細胞是貼壁依賴型成上皮樣細胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細胞的表型，細胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293細胞為人亞三倍體細胞系。293細胞在無Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生長，也可生長在血清濃度降低的培養(yǎng)基中。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應器接種細胞準備的一條途徑。與傳統(tǒng)靜止單層培養(yǎng)相比，轉(zhuǎn)瓶具有三大優(yōu)點：為細胞提供較大的生長表面；輕微的轉(zhuǎn)動可以防止培養(yǎng)液中形成的某些成分對細胞生長可能產(chǎn)生的影響；細胞大部分時間僅覆蓋一薄層培養(yǎng)液，有利于氣體交換。我們已成功實現(xiàn)293細胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。由于293細胞對生長環(huán)境的改變較為敏感，細胞容易成團，因此維持穩(wěn)定的溫度，酸堿度和轉(zhuǎn)動速度對細胞正常均勻生長至關(guān)重要?，F(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機兩部分。293細胞接種后，維持適當?shù)霓D(zhuǎn)速培養(yǎng)。不同的細胞轉(zhuǎn)速略有不同。細胞的均勻分散貼壁情況與培養(yǎng)液溫度，瓶子的轉(zhuǎn)動速度和細胞特性有關(guān)。在5-6天的培養(yǎng)周期中，細胞量可增殖20倍。

反應器貼壁培養(yǎng)

此種培養(yǎng)方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細胞的生長情況，故多用于制備用量較小，價值高的生物藥品。 CelliGen，CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器是常用的貼壁培養(yǎng)式生物反應器，用于細胞的貼壁培養(yǎng)時可使用籃式攪拌系統(tǒng)和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米的無紡聚酯纖維圓片，具有很高的表面積與體積比(1200cm2/g)，有利于獲得高細胞密度?；@式攪拌系統(tǒng)和載體培養(yǎng)是目前貼壁細胞培養(yǎng)使用最多的方式，除用于293細胞的培養(yǎng)外，還用于雜交瘤細胞培養(yǎng)，Hela細胞培養(yǎng)，CHO細胞培養(yǎng)及其它細胞培養(yǎng)。此種方式培養(yǎng)293細胞，細胞接種后貼壁快，接種1小時后細胞貼壁率可達98%以上，采用灌流培養(yǎng)。整個培養(yǎng)周期約7-10天，細胞增殖25-50倍。

微載體培養(yǎng)

微載體是目前最有發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細胞，生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細胞，成肌細胞，Ve r o細胞，CHO細胞。常用商品化微載體有三種：Cytodex ，Cytopore和Cytoline。 使用較多的反應器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT B反應器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen，CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實現(xiàn)培養(yǎng)細胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。微載體培養(yǎng)293細胞，首先要選擇合適的微載體類型和攪拌速度。接種細胞可用1L spinner微載體培養(yǎng)系統(tǒng)或是其它貼壁培養(yǎng)方式準備，采用灌流培養(yǎng)，培養(yǎng)周期10-15天，能達到的細胞密度為5-10×106/ml。

無血清懸浮培養(yǎng)無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。要實現(xiàn)293細胞無血清懸浮培養(yǎng)必須先將貼壁培養(yǎng)293改造為懸浮培養(yǎng)293S細胞并尋找適合高密度無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)液配方。懸浮培養(yǎng)時，由于缺少血清和蛋白的保護作用，293S對剪切力的敏感度增加，難以達到高密度培養(yǎng)，導致293S產(chǎn)生病毒的數(shù)量比貼壁培養(yǎng)低5-10倍左右。細胞接種后，灌流培養(yǎng)7天，達到細胞密度5×106/ml，增殖5-10倍。