細(xì)胞復(fù)蘇技巧，MDL科研助手來(lái)支招

細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個(gè)細(xì)胞，也可以是細(xì)胞系。細(xì)胞復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，下面小編具體給大家介紹下細(xì)胞復(fù)蘇的protocal和注意事項(xiàng)！

01、細(xì)胞復(fù)蘇的原理

細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)的過程。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常，生化反即刻恢復(fù)。細(xì)胞復(fù)蘇過程升溫要快，原則是慢凍快融，防止在解凍過程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。

02、細(xì)胞復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)步驟

1. 從液氮罐中取出凍存管，置于-80℃冰箱數(shù)分鐘，迅速放入37℃水浴鍋中，不時(shí)搖動(dòng)，使其在2min內(nèi)急速融化，注意不要把凍存管的管口沒入水浴中避免引起污染，復(fù)蘇過程中一般細(xì)胞死亡率在25%左右；

2. 融化后，凍存管用75％酒精擦拭冷凍管外殺菌后，打開蓋子，取出凍存管的細(xì)胞懸液，緩慢加入到有培養(yǎng)液的T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO培養(yǎng)。如果細(xì)胞需要去除冷凍保護(hù)劑，用移液槍將細(xì)胞懸液注入15mL無(wú)菌離心管中，

再加5ml培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的離心速度，低速離心5min，棄去上清，加入2-3mL預(yù)熱的培養(yǎng)基，輕輕吹勻，保證細(xì)胞重懸；

3. 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，將重懸的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿或者T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO培養(yǎng)，24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，去除死細(xì)胞，三天可進(jìn)一次換液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到有80-90%匯合進(jìn)行傳代。

03、細(xì)胞復(fù)蘇的注意事項(xiàng)

1. 取凍存細(xì)胞時(shí)應(yīng)做好防護(hù)措施，戴好防凍手套，護(hù)目鏡。如果凍存管密封不嚴(yán)，液氮可被吸入。由于解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，將可能發(fā)生爆炸。

2. 細(xì)胞放入水浴中復(fù)蘇時(shí)注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時(shí)晃動(dòng)，使其受熱均勻，且速度越快越好，這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力，并防止水浴鍋的水進(jìn)入細(xì)胞凍存管造成細(xì)胞污染。

3. 打開細(xì)胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏?。注意無(wú)菌操作，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作在4℃冰盒中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性。

4. 解凍時(shí)間在2min以內(nèi)完成，且整個(gè)過程盡量避免吹打細(xì)胞產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇后的生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。

5. 復(fù)蘇細(xì)胞的時(shí)候盡量避免凍存管接縫處沾水，防止支原體污染，實(shí)驗(yàn)室定期用過氧化氫熏蒸，細(xì)胞小黑點(diǎn)增多時(shí)用支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，并且及時(shí)清除。

04、如何避免凍存管爆炸

1.  選擇質(zhì)量好的進(jìn)口內(nèi)旋凍存管，擰緊蓋子，防止液氮進(jìn)入管內(nèi)，液氮罐的細(xì)胞留種用，平時(shí)常用的細(xì)胞放在-80冰箱。

2. 凍存細(xì)胞時(shí)盡量加多一點(diǎn)凍存液，比如2ml凍存管加1.8ml凍存液，保留少量空間。

3. 取細(xì)胞時(shí)帶好手套和防護(hù)眼鏡，準(zhǔn)備好鑷子，避免手直接接觸凍存管造成手凍傷或炸傷。

4. 從液氮里取出細(xì)胞時(shí)，先在液氮罐上面的蒸汽里放一會(huì)，然后再拿出來(lái)，將凍存盒殘余的液氮流到罐內(nèi)，避免拿出時(shí)凍傷，也避免細(xì)胞從液氮迅速升到室溫發(fā)生爆炸。