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免疫熒光染色封片技巧

更新時(shí)間:2024-07-17      點(diǎn)擊次數(shù):604

免疫熒光染色是實(shí)驗(yàn)室常用的技術(shù)之一,但在操作過程中,有許多需要注意的細(xì)節(jié),任何一個(gè)環(huán)節(jié)的失誤都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。本文將為您介紹免疫熒光染色的注意事項(xiàng)。




1. 抗體選擇:選擇針對(duì)您研究的目標(biāo)蛋白特異性高、親和力強(qiáng)的抗體,一抗的濃度需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索。一抗?jié)舛冗^高(本身熒光實(shí)驗(yàn),一抗的濃度就較高),也是造成自發(fā)熒光強(qiáng)的重要原因。




2. 抗體稀釋:根據(jù)抗體說明書建議,使用合適的稀釋液和稀釋比例進(jìn)行抗體稀釋。




3. Blocking:使用合適的Blocking 液進(jìn)行Blocking 處理,以減少非特異性結(jié)合,一般采用動(dòng)物血清,在室溫下封閉1h左右。建議適當(dāng)延長封閉的時(shí)間至2h。如果室溫較低,可以考慮采用37℃孵育箱進(jìn)行封閉,優(yōu)化封閉時(shí)間,充分去除組織中的類屬抗原。




4. 二抗選擇:選擇與一抗種屬匹配的熒光標(biāo)記二抗,二抗在4℃長時(shí)間放置后可能有部分熒光素沉淀,導(dǎo)致染色結(jié)果有星星點(diǎn)點(diǎn)的雜質(zhì),損失珍貴樣本!建議配成工作液后,高速離心,取上清使用。




5. 洗滌:在每一步操作后,充分洗滌以去除未結(jié)合的抗體和染料。




6. 封片:選擇合適的封片劑進(jìn)行封片,避免熒光淬滅。




7. 對(duì)照設(shè)置:設(shè)置合適的陽性和陰性對(duì)照,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。





封片技巧:



在滴加封片劑之前,確保切片上沒有多余的液體。封片劑也不宜添加過多,可用10ul槍頭吸取少量,點(diǎn)在每個(gè)樣品邊緣,緩慢蓋片。




滴加適量的封片劑,避免產(chǎn)生氣泡。


用10ul槍頭滴加~5ul/樣品(根據(jù)組化筆大小 酌情更改封片劑滴加量) 千萬不可打出氣泡!不要把槍頭最后一滴封片劑打出!氣泡會(huì)嚴(yán)重影響封片效果!


如果不小心產(chǎn)生氣泡 → 可以用鑷子輕輕將氣泡擠出。




使用干凈的蓋玻片,輕輕按壓,使封片劑均勻覆蓋切片。




避免在蓋玻片上留下指紋或污漬。


希望 這些技巧能幫助您順利完成實(shí)驗(yàn)。


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